Síntesis artificial de Ácidos Nucleicos
• Ácidos Nucleicos
Los ácidos nucleicos son moléculas formadas por unidades estructurales llamadas nucleótidos. Estas moléculas fueron descubiertas 1869, por Meischer, él llamo esta sustancia en un principio Nucleina, por encontrarse en el núcleo de las células.
“…El descubrimiento de los ácidos nucleicos se debe a Meischer (1869), el cual trabajando con leucocitos y espermatozoides de salmón, obtuvo una sustancia rica en carbono, hidrógeno, oxígeno, nitrógeno y un porcentaje elevado de fósforo…”(1)Tiempo después esa Nucleina se fragmento en un componente proteico y un grupo prostéico (ácido nucleico). Para 1953 James Watson y Francis Crick descubrieron la estructura tridimensional del Ácido desoxirribonucleico (ADN). Este está formado muchos desoxirribonucleótidos, posee dos cadenas antiparalelas unidas entre sí, las cuales están formadas por las bases nitrogenadas, Timina, Guanina, Adenina y Citosina, unidas por los puentes de Hidrogeno.
El ADN es el portador de la información genética por lo tanto se puede decir que es el encargado a lo que herencia genética se refiere.
“…La adenina enlaza con la timina, mediante dos puentes de hidrógeno, mientras que la citosina enlaza con la guanina, mediante tres puentes de hidrógeno.El ADN es el portador de la informacion genética, se puede decir por tanto, que los genes están compuestos por ADN…”(1)
Figura I. Estructura de la doble Hélice de ADN, Biología 2,Santillana
Por otra parte el ARN es una molécula formada por la unión de ribonucleótidos en una sola cadena y así como el ADN esta se refiere a la secuencia de las bases nitrogenadas; guanina, citocina, adenina y uracilo, los cuales están unidos por enlaces fosfodiester. El ARN se subdivide en varios tipos:
• ARN mensajero: tiene información para sintetizar una proteína determinada.
• ARN ribosómico: forma subunidades ribosómicas al unirse a las proteínas.
• ARN nucleorar: se sintetiza en el núcleo.
• ARN de transferencia: encargado de unir aminoácidos y transportarlo al ARNm para la síntesis de proteínas.
“..Al igual que el ADN, se refiere a la secuencia de las bases nitrogenadas que constituyen sus nucleótidos(1)
Figura II. Estructura de ARN, Biología 2,Santillana
¿Qué es la síntesis artificial de Ácidos Nucleicos?
Este es un procedimiento que nace alrededor del año 1958, producto de la investigación del Dr.Arthur Kornberg y del Prof. Severo Ochoa.
A estos científicos se les galardono con el Premio Nobel por su trabajo acerca de la síntesis artificial de ácidos nucleicos por medio de enzimas. Ellos lograron purificar la ADN polimerasa de un extracto de E.coli
Las técnicas en biología molecular han surgido en los últimos 20 años como un complemento a los métodos tradicionales de morfología, citogenética e inmunofenotipo, para el correcto diagnostico de diversas patologías en especial las de tipo hematológico. Sus orígenes se pueden describir a partir del modelo propuesto por Watson y Crick en 1953; y las ya mencionadas investigaciones de varios científicos en 1958.
En 1971 se propone la técnica llamada reacción en cadena de polimerasa(PCR), Esta es una prueba de Biología Molecular que se basa en la amplificación de ADN, para obtener gran número de copias de un gen en particular partiendo de un patrón establecido, sin embargo dicha técnica no se pudo desarrollar por las limitaciones de la época y es hasta 1986, Karl Mullis y sus colaboradores desarrollaron la propuesta de una PCR más sencilla, y tres años aplicaron la teoría para el procedimiento de la reacción en cadena de polimerasa.
“.. Hasta 1986 cuando Karl Mullis y colaboradores describieron en la revista Science una versión simple de PCR para la amplificación de un fragmento de ácido nucleico; y tres años después, el mismo grupo simplificó el procedimiento al descubrir una ADN polimerasa termoestable purificada de Thermus aquaticus (Taq polimerasa).(3)Actualmente el desarrollo artificial de los ácidos nucleicos ha revolucionado el mundo de la medicina convirtiéndose en una herramienta fundamental para el diagnostico de enfermedades y el descubrimiento de muchos de los enigmas que rodean al ser Humano y su composición genética.
Referencias:
1. Aula virtual de Biología, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Complutense de Madrid, 2007. Ácidos Nucleicos . En línea fecha de consulta 31/marzo/2011. Disponible en: http//www.ucm.es/molecula/indice.htm.
2. Berg Linda, Pearl Salomon Eldra, Ville Claude, W. Martin Diana, 1998. Biología de Ville. Cuarta Edición. Mc Graw Hill. México.
3. Santamaría. C. 2010. Generalidades sobre biología molecular, Conceptos Básicos de Biología Molecular y sus Aplicaciones en la Hematología. capitulo 39.
4. Santamaría Carlos. PhD en Biología Molecular. Jefe del Laboratorio de Biología Molecular del Hospital Nacional de Niños, C.R. (HNN).Marzo 2011.
• Técnicas artificiales para la síntesis de ácidos nucleicos
La síntesis artificial de ácidos nucleicos está basada en la técnica de reacción en cadena de polimerasa (PCR), esta prueba es el fundamento de lo que hoy se conoce como biología molecular.
La PCR, como tal es un procedimiento que tiene varias formas de llevarse a cabo, cada una se adapta a los objetivos para los que serán utilizados. Entre las clasificaciones más comunes de la PCR están:
• PCR cualitativa:
Esta técnica permite la amplificación selectiva de un fragmento especifico de ADN estos segmentos se delimitan por dos secuencias de nucleótidos complementarios a ese ADN de interés, estos son conocidos como oligonucleótidos o primers, estos primers se mezclan con un buffer (KCl), taq polimerasa, Mg (cofactor de la enzima) y desoxinucleotidos (dNTP), agua libre de ADNasa y el ADN de interés. Esta mezcla luego se somete a una serie de de temperatura.
Durante estos ciclos se cumplen tres etapas: separación de la doble hebra de ADN, unión de los primers a la secuencia de interés y la elongación de la hebra complementaria con los respectivos dNTP.
Al terminar este proceso se somete el producto a una electroforesis sobre un gel de agarosa con bromuro de etidio (EtBr) para que los distintos fragmentos migren y se separen por peso molecular. Los productos de PCR se visualizan como “bandas” fluorescentes.
“…Para determinar el tamaño del producto en pares de bases (pb), se agrega una escalerilla de peso molecular, con mezclas de fragmentos de ADN de número de pb…” (2)
Figura 1. Ejemplo de una determinación por RT-PCR cualitativa del gen BCR-ABL, (Tomado de van Dongen et al, 1999;13:1901-28).
Esta PCR, puede realizarse a partir de ADN o ARN, este último con el inconveniente de que es una molécula fácilmente degradable y expuesta a gran cantidad de ARNasas, por lo que el material genético de preferencia es el ADN ya que si se utiliza el ARN este se convierte a ADN mediante la técnica de transcriptasa inversa.
• PCR anidada
Para esta PCR es utilizando el producto de una PCR cualquiera que sea, en ella se somete ese producto de una primera PCR a un nuevo proceso de termociclado utilizando primers internos que reconocen secuencias dentro de ese producto.
• Gene scanning
Esta es una alternativa a la PCR convencional, para ella se necesita utilizar un primer marcado con fluorocromo, esta se realiza con la ayuda de un escáner o secuenciador , el cual posee un soporte de poliacrilamida acoplado a un láser que
excita el fluorocromo, el cual a su vez emite fluorescencia que la detecta el scanner al pasar el producto frente a él durante la corrida electroforética, esta técnica en comparación con la PCR Cualitativa , es muy laboriosa y costosa en equipos y reactivos.
Figura 2. Ejemplo de una determinación por gene scanning de la duplicación en tandem del gen FLT3
• PCR cuantitativa en tiempo real
La técnica de PCR cuantitativa por tiempo real (RQ-PCR) ha surgido como una alternativa a la PCR convencional para el estudio de hemopatías malignas, a partir de los estudios multicéntricos.
Figura 3. Determinación por RQ-PCR comparando la curva incógnita (x) con 3 estándares de número de copias conocida.(1)
“...Al medir una señal fluorescente durante o inmediatamente después de cada ciclo de PCR, lo cual permite tener resultados cuantificables en forma continua, sin necesidad de manejo post-PCR. La fluorescencia viene dada por una variedad de sondas o moléculas que se unen al producto amplificado…”(2)
Si comparamos la PCR tiempo real con la PCR cualitativa, la RQ-PCR presenta una serie de ventajas tal como un alto rendimiento, parcial automatización del proceso y menor riesgo de falsos positivos debidos a contaminación cruzada. Sin embargo, los aspectos que la convierten en una tecnología más confiable son :
• La posibilidad de introducir un control interno para evaluar la integridad del ARN y la retrotranscripción a ADN copia en cada grupo de muestras.
• Un seguimiento preciso de la cinética de la carga del gen a identificar.
Secuenciación
El objetivo de estas técnicas es lograr identificar la secuencia específica de nucleótidos de un fragmento de ADN. En resumen, se realiza una PCR para amplificar el gen o translocación de interés. Este producto de PCR es purificado para eliminar restos de dNTP y primers y se le somete a una reacción de secuenciación.
“… A pesar de su alta sensibilidad y especificidad , la PCR no es una técnica exenta de limitaciones. Un problema importante son los falsos positivos debidos a la contaminación de muestras, principalmente en los métodos basados en ARN. Por ello, es necesario la inclusión de muestras control y extremar las medidas para evitar la contaminación…”(3)Referencias:
1. Barzuna. L, Calvo. M, Pérez. C, Santamaría. C. Manual de técnicas y procedimientos, División de Biología Molecular. Hospital Nacional de Niños. Editado por Departamento de Gestión de Calidad Laboratorio Clínico HNN. San José, C.R. 2010.
2. Santamaría. C. 2010. Generalidades sobre biología molecular, Conceptos Básicos de Biología Molecular y sus Aplicaciones en la Hematología. capitulo 39.
3. Santamaría Carlos. PhD en Biología Molecular. Jefe del Laboratorio de Biología Molecular del Hospital Nacional de Niños, C.R. (HNN).Marzo 2011.
Principales usos de los ácidos nucleicos sintetizados artificialmente
Uno de los principales aportes de la biología molecular por medio de la síntesis artificial de ADN, ha sido la participación en el diagnostico de enfermedades hematológicas así como de otras patologías. Los aportes más relevantes de la biología molecular se han visto reflejados en los procesos leucémicos, más que en cualquier otro trastorno hematológico u oncológico en general.
Los diferentes genes que son detectados por las técnicas moleculares, son de gran importancia para el adecuado manejo del paciente, su diagnostico y seguimiento a lo largo de su tratamiento.
Mediante esta técnica se ha logrado evidenciar genes producto de translocaciones cromosómicas y rearreglos monoclonales de inmunoglobulinas para síndromes proliferativos de línea B o del receptor de células T.
“… Esta determinación puede evidenciar genes de fusión producto de translocaciones cromosómicas detectadas o no por citogenética (ejemplo la t(12;21) la cual no se detecta por citogenética pero su producto TEL-AML1 sí se detecta por RT-PCR)…”(2)
Diagnóstico de enfermedades por PCR.
Al momento de diagnosticar un proceso de tipo Hematologico, se procede a la clasificacon del mismo por medio de PCR, esto con el fin de aplicar al paciente el tratamiento mas adecuado. Esto se puede realizar mediante las diferentes técnicas de PCR(cuantitativa o cualitativa)
Una clasificada la patología se procede a la evaluación del pronostico o probabilidad de vida del paciente, esto también puede llevarse a cabo mediante la técnica molecular. Según la alteración cromosómica o gen evaluado, se puede establecer si el paciente es de alto, mediano o bajo riesgo.
“…Por ejemplo, la LLA-B con TEL-AML1 es de buen pronóstico, mientras que las LLA-B con alteraciones del 11q23 tienen un pronóstico reservado…” (1)
Seguimiento
Una vez establecido el tipo y clasificación del trastorno(principalmente hematológico), los procedimientos moleculares sirven para valorar el éxito de la terapia aplicada y la determinación de la enfermedad mínima residual.
“…Enfermedad Mínima Residual es un término que define un pequeño grupo de células remanentes que queda en el organismo posterior a una quimioterapia (QTx) de inducción, las cuales son responsables de eventuales recaídas de los pacientes, las cuales son altamente resistentes a la QTx y presentan alta tasa de mortalidad.”(2)
Respuesta a tratamiento
Los ejemplos clásicos son la determinación del rearreglo BCR/ABL en pacientes con LMC o la detección del PML/RAR para los pacientes de LPA.
Entre los trastornos Hematológicos para los cuales es de mucha utilidad la biología molecular podemos citar:
Leucemia mieloblástica aguda no M3: constituye la forma más frecuente de leucemia aguda en adultos y hasta un 30% en niños.
Figura1. Leucemia Mieloblástica aguda
Leucemia promielocítica aguda (LPA): constituye aproximadamente un 15% de todas los casos de leucemias mieloides aguda (LMA), con una mayor incidencia (20-30%) en los países mediterráneos y en América Latina. La LPA se caracteriza por un predominio de promielocitos malignos
Figura 2.Leucemia Promielocítica aguda
Leucemia mieloide crónica: La leucemia mieloide crónica (LMC) se caracteriza por la presencia del gen de fusión BCR-ABL o cromosoma Philadelphia positivo, producto de las translocación t(9;22)(q34;q11).
Figura3.Leucemia Mieloide crónica.
Aunque la biología molecular este más orientada a las patologías de origen hematológicas, no solamente colabora con esta parte de la medicina, sino también se encuentra involucrada en el diagnóstico de enfermedades causadas por paracitos y bacterias como por ejemplo: la leishmania, la tuberculosis, enfermedades respiratorias causadas por bordetella, mycoplasma, chlamydophila, clasificación e identificación de E. coli productoras de diarreas, identificación de staphylococcus sp., diagnostico de herpes, Erlichiia entre otros.
Actualmente el campo de la biología Molecular se está apoderando de la medicina, y día a día avanza cada vez más, haciendo menos complicado el diagnostico y adecuado tratamiento de muchas enfermedades .
Referencias:
1. Barzuna. L, Calvo. M, Pérez. C, Santamaría. C. Manual de técnicas y procedimientos, División de Biología Molecular. Hospital Nacional de Niños. Editado por Departamento de Gestión de Calidad Laboratorio Clínico HNN. San José, C.R. 2010.
2. Santamaría. C. 2010. Generalidades sobre biología molecular, Conceptos Básicos de Biología Molecular y sus Aplicaciones en la Hematología. capitulo 39.
3. Santamaría Carlos. PhD en Biología Molecular. Jefe del Laboratorio de Biología Molecular del Hospital Nacional de Niños, C.R. (HNN).Marzo 2011.
Publicado por: Johanna Campos P.
Universidad Internacional de las Américas
I Cuatrimestre 2011.
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